流式细胞仪的原理是什么
最近一直在了解流式细胞术和流式分选的知识，看到这个问题想回答一下：
流式细胞仪是以流式细胞术为基础，快速精确的对单个细胞的理化性质进行定量分析和分选。分析流程为：制备单细胞悬液，用特异性荧光染料标记的抗体进行染色，经染色后的待测细胞在一定气体压力下被压入流动室，在鞘液的包裹下细胞呈单行排列，依次通过检测区域，在激光束的照射下细胞会产生散射光和激发荧光。这两种信号会同时被光电倍增管( PMT) 接收。接收后可转换为电信号，通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，进行分析。
如上所述，流式细胞仪是由液流系统、光路系统以及检测分析系统三部分组成，部分仪器还具有分选功能，能对粒子进行充电和偏转从而实现细胞分选。
液流系统：通过产生压力使含有目的细胞的样本快速进入仪器，在封闭的样品管中利用样品和鞘液之间的压力差是样本聚集到光学分析系统；
光路系统：由不同的激光器发射出的激光照射到细胞表面产生光信号，而后经过不同的光路系统被接收。在流式照射室的分析点，激光照射到细胞表面发生散射和折射，并发射出散射光包括前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）,同时细胞表面的荧光素被激发发射出荧光。前向散射光和侧向散射光检测器收集散射光转变为电信号；荧光则被聚光器收集，不同颜色的荧光被双色反光镜转向不同的光电倍增检测器，将荧光信号也转变成电信号。FSC和SSC是流式分析中两个非常基本的参数。FSC的值能代表细胞的大小，细胞的体积越大则FSC就越大。SSC则代表细胞的颗粒度，细胞内细胞器和颗粒度越大则SSC越大。
检测分析系统：荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原强度或细胞内物质的浓度，光信号转换为可被计算机识别的电信号。计算机把所测量的各种信号进行处理分析。
流式细胞分选是在流式细胞术的基础上进行的。在流动室的喷口上方配有一个超高频的压电晶体，产生的振动使喷出的液流形成均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷（对标有荧光素的细胞液滴带以负电荷；未标记荧光素的细胞液滴带以正电荷；而不含有细胞的液滴则不被带电荷），当液滴流经偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不带电荷的液滴落入废液容器，从而实现细胞的分离。
第一次回答希望能帮到你，如有理解不当的地方，欢迎指正！
流式细胞仪，什么是流式细胞仪
流式细胞仪（Flow cytometer ）是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
流式细胞仪的原理是什么？
我简单说一下：
1. 首先，机器吸取细胞混悬液，射入由鞘液（一般都是磷酸盐缓冲液）。由于鞘液的流速大，所以细胞混悬液通过轴流的形式在中央，一般是单个细胞排队的形式。
2. 然后细胞通过检测窗口。有激光束照射。一般细胞都经过荧光染色，被激光照射后，会有不同波长的激发光产生。机器设有检测器来探测激发光的强弱
3. 根据激发光的强弱，来判断细胞和染色物质的结合情况，从而得到要检测的结果（比如抗原量，DNA量，等等）
请问流式细胞仪检测细胞凋亡的原理是什么？
一、原理
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
二、注意事项
1、必须活细胞检测，不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。
2、特殊细胞的染色方法：在消化或吹打时，有些细胞（如神经元细胞）很容易受到损伤，导致晚期凋亡或坏死比例非常高，不能反映真实结果。实验的解决方法：先低速离心，吸取细胞培养板中的液体，留少许液体，加入适量PI和Annexin-V染色10min后，将漂浮细胞吸至离心管中，离心洗涤两次，用PBS漂洗贴壁细胞两次，加胰酶消化后将细胞悬液移至另一离心管中，离心洗涤，再与漂浮细胞合并后上流式细胞仪检测。应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例，增加早期凋亡细胞比例。
3、由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白，只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大，因而在消化细胞时，建议一般不采用含EDTA的消化液。
4、必须设置阴性对照和补偿对照（分别单染）。
流式细胞仪的原理和操作过程
原理：
流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。
在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。
在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。
荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。
减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。
操作过程：
①打开电源，对系统进行预热；
②打开气体阈，调节 压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；
③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；
④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的 基础上，0和90散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；
⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选 择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；
⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；
⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭 气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；
⑧将所需结果打印出来。
流式细胞仪检测的原理
很简单的啊。
流式细胞仪数据分析
5.1 数据采集及显示
光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。 流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。
根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。 4参数（FSC，SSC，FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据。当单个样品累计收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。
数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图5-1）。处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。 图5-1 流式数据分析图
双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1），Y轴显示通道2（FL2）。3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）。
习题：数据采集及显示
1 在直方图中横轴和纵轴分别表示 。
2 二维点图用于显示 参数。
3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表 。
5.2 设门
通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。 图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图
习题：设门
1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。（对 错）
5.3 细胞亚群的数据分析
数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。 如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。
图5-3 选定淋巴细胞亚群设门
门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。在下面的实例中，我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。 我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。如果需要，还可以建立数据统计表以输出结果。 直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界（见图5-4）。左图中M1为阴性对照峰。右图中M2为CD3 FITC阳性峰。
图5-4 阴性对照峰M1（NORM001）和CD3 FITC阳性峰M2（NORM002） 图5-5的统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。其中M1（阴性）细胞619个，M2（CD3阳性）细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为：M2：2272/2891=78.59%。
图5-5 直方图统计结果
二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图5-6为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19 PE），左下象限（LR）为X轴阳性细胞（CD3 FITC），右上象限（UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。
图5-6 阴性对照组(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE双染样本(NORM002) 如图5-7所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百分含量为：296/2839=10.43%。
图5-7 散点图统计结果 另一个分析方法是划定区域，也就是设门。我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域（如图5-8所示）；然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。在图5-9中，R4门内为CD4阳性，CD3阴性的淋巴细胞亚群，其结果为：40/2866=1.40%。
图5-8 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本分析图 图5-9 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本数据统计结果
这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷，因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界，在随后的文件中，下一个样本的细胞亚群位置会发生变化，这就需要操作者重新调整区域或边界位置。 为避免这种情况的发生，我们采用一种称为集群分析（cluster analysis）的新方法。BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM软件就属于集群分析软件。该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动，自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置（见图5-10）。
图5-10 使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化对比
5.4 流式细胞仪的其它应用以及数据分析
这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。因为单克隆细胞株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是100%阴性，也不是100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高，阳性率越高。 如图5-11所示，左图为单细胞群的散射光信号，右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。每个峰的几何均值分别为2，5和20（从左至右）。
图5-11 单细胞株分析图 除检测阳性率，几何均值法和中位法还用于分子（接合子）定量分析。
QuantiCALCTM软件就是使用中值法计算每个细胞的抗体结合位点数。如图5-12所示，Y轴上的圆圈代表从标准曲线获取的信息，用于计算每个细胞的接合点位数。 图5-12 使用QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数 我们使用ModFit LTTM软件进行DNA定量分析。因为DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是离散的，所以我们对曲线以下的面积进行积分，以得到每个细胞亚群的百分含量结果。
图5-13 细胞周期的DNA直方图
习题：数据分析
1二维点图和一维直方图的作用分别是什么？
2 见图5-4和图5-5，CD3阴性和阳性的百分含量分别是多少。
3 LL象限代表双阳性细胞亚群。（对 错）
4 见图5-6和图5-7，淋巴细胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。
5 只能使用矩形设定细胞区域范围。（对 错）
6 使用区域设定法分析样本有哪些不足。
7 避免细胞亚群移动的分析方法是什么。
8 在定量分析中我们使用哪些分析方法检测阳性率。
5.5 CellQuest和CellQuest Pro软件使用
CellQuest和CellQuest Pro软件是目前运用最为广泛的流式细胞仪采集及分析软件。它运行于苹果电脑上，优质的矢量图显示使得操作界面特别优美。现最新的微软公司的Vista软件也是仿苹果操作系统界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro时的强大功能及视觉质感。CellQuest和CellQuest Pro软件主安装在BD FACSCalibur型流式细胞仪上。
1．软件数据流程
在CellQuest和CellQuest Pro软件的数据流分为二个部分：方案和数据包。方案是指用户可以建立采集或分析所需的直方图或散点图、设门并定义门与门、门与图之间的逻辑关系。可以使用方案进行数据采集或分析以往已有的数据。每个采集方案分析样本后会生成数据包，该数据包中包括了样本中每个颗粒在各个检测参数上的数值，格式为FCS2.0或FCS3.0。
数据包必须由方案文件打开，无法单独显示，或者可由第三方软件进行分析，如WinMDI。
2.软件与仪器的连接
流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息，所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪，然后再开启计算机。
1、先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。
2、在苹果菜单下点击CellQuest和CellQuest Pro软件。
3、从Aquire菜单下选择connet to cytometer。
3．方案与数据之间的关系
CellQuest和CellQuest Pro软件的方案与数据相互独立保存，数据包可以由任一方案文件进行分析，分析后不改变数据包中的任何数据。CellQuest和CellQuest Pro软件中方案内的直方图或散点图有三种状态：Acquire，Analysis和Acquire-Analysis。
当图的属性为Acquire时，此图只限于采集下用，即只当进行检测时它才能显示颗粒；
当图的属性为Analysis时，此图只限于分析已保存的数据包，它不能用于采集数据。
当图的属性为Acquire-Analysis时，此图即可用于采集数据也可用于分析已有数据。
所以方便起见，我们一般将方案中的直方图或散点图全部设为Acquire-Analysis属性。
CellQuest Pro CellQuest
4．方案的建立
A选择实验参数
默认情况下，FACSCalibur流式细胞仪开机后只打开一根激光器，及五个参数供选择使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3。当我们要使用第二根激光器及FL4通道时需要勾选FL4的选项，仪器自动打开633nm激光器。
B,建立散点图或直方图，命名坐标
CellQuest Pro软件主要工作界面，软件类似于Office word的工作面，可在A4大小的页面上进行编辑建立各种直方图或散点图。
在CellQuest软件下，需在选择Plot菜单，选择Format来打开图的属性对话框，其中包括了关于该图所有选项。
建立好直方图或散点图后，我们需要对所选的参数进行命名，如不修改软件自动命名为FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4。
在菜单上选择Acquire栏目，选择Parameter Description，可出现关于文件存储和参数命名的对话框。在这个对话框中用P字母来代表每个参数，并在此对每个采集参数进行命名，FL1为CD3FITC，FL2为CD4PE……。
C,设门并建立门与图之间的关系
R与G的关系
R是Region的首个字母，Region一般是指一个闭合形的区域，如矩形区、自由区和圆形区。区域与区域之间可以进行逻辑运算，如AND、OR、NOT等关系。当区域进行运算时软件引进了算术公式的管理概念：
Gate实际了个代数式，简称G，其运算式默认如下：
G1 = R1，或G2=R2
当我们要进行逻辑运算时，可变更为G1=R1 AND R2。此时G1就成了一个算术结果了。
G1=R1 AND R2
G2=R1 NOT R2
G3=R1 OR R2
Region List管理门，可以重命名或删除门。Gate List是对门进行逻辑运算和标识颜色的工具。
建立门与图之间的关系
打开要编辑的直方图或散点图的属性对话框，选择Gate选项，选择门即可。
D，显示统计参数
5．仪器的操作
当计算机与流式细胞仪联机后便会出现以下采集控制框：
在有关仪器操作所有控制选项框都在Cytometer下拉菜单下，同时按住“苹果”键及1、2、3、4便可调取所有控制框：
6．文件的保存及调用
实验或分析过程中所建的方案可以保存下来，通File下拉菜单可以保存这些方案文件：
如要打开这些分析方案只需双建方案图标即可；方案可以分析以往的数据包（前提是方案中的直方图或散点图都已定义成Acquire-Analysis属性），有两种方案打开以往的数据：
方法一：选择直方图或散点图，打开该图的属性框（Plot->>Format），见下图：
在以上红色框标注的地方选择要分析的数据包。
方法二：选中方案中所有的直方图或散点图，打开Plots菜单，选择Chang Data File，打开要分析的数据包。
附：CellQuest Pro软件所有下接菜单
流式细胞仪计数法原理是什么
流式细胞仪是通过激光对通过激光束的颗粒进行计数。
当颗粒或者细胞通过激光束的时候，会对光线产生折射和反射。这个折射和反射的信号被探测器记录下来。每通过一个细胞，就会产生一个峰值，最后记录峰值的个数，就可以计数了
流式细胞术的实验原理是什么？主要有哪些应用
简单的给你概况一下：
细胞或者大小接近的颗粒物质都可以检测。样本通过鞘液的输送，成单个队列依次通过激光束。样本事先可以根据检测需要被荧光标记，通过激光束的时候就会得到荧光信号，被记录下来。可以同时标记不同的荧光标记做不同的检查。优点就是可以在短时间内检测大量的样本（每秒几千个到几万个细胞）。
主要应用于各种生物医学研究和临床诊断。国际上通用的白细胞和淋巴瘤的诊断标准就是靠流式细胞仪的分型来确定的。
简述流式细胞仪,酶免疫自动分析系统的基本原理
流式细胞仪的原理
流式细胞仪测定细胞周期各时相的原理和基本步骤（不用说具体使用的量）
在细胞培养液中加入模拟核苷酸EdU （比较老的方法也可以用BrdU）。培养一小时 后，更换为正常的培养液继续培养。模拟核苷酸可以像天然核苷酸一样被细胞摄取并整合入新合成的DNA。
培养一段时间后（一般小于一个细胞周期），固定细胞。根据所使用模拟核苷酸的不同，使用不同的方法。EdU，改变缓冲液的pH值，就会发出荧光。而BrdU则需用荧光抗体识别，需要对细胞膜和核膜进行通透处理。
再加入PI对DNA染色。
在二维坐标图上，横坐标设为线性PI荧光强度，纵坐标设为模拟核苷酸的荧光强度（log）。
典型的图就像下面一样：
G1, G2 和S期就按照图中的划分来做。G1期的细胞没有新合成DNA，所以BrdU信号是阴性，而PI的信号位于1倍体期。S期是正在合成DNA，所以BrdU都是阳性。G2期是已经合成好了2倍的DNA，所以位于2倍体期，信号是G1期的一倍。这个图中，G1 PI信号是300， G2就是600.
扩展
谢谢您的回答，我还想问一下这题：说明并画图表示测定细胞周期各时相时间的方法。这是一考研题，应怎么答
补充
测时间的话，就是标记好以后，在不同时间点去样本检测，比如每小时测一份。这样就会有各个期百分率的变化。可以算出每个期的时间